在生命科学研究领域，细胞和微生物的培养是探索生命奥秘、攻克疾病难题的重要基础。而培养环境的精确控制，直接关系到培养对象的生长状态和实验结果的准确性。博清生物科技（南京）有限公司研发生产的三气培养箱凭借其能够精准调控氧气、二氧化碳和氮气浓度，同时维持稳定温度和湿度的特性，成为科研实验中不可或缺的关键设备。本实验将通过开展肿瘤细胞低氧培养和厌氧微生物培养两项研究，探究三气培养箱在不同科研场景下的实际应用效果。

一、 实验目的

1、利用三气培养箱模拟肿瘤组织低氧微环境，研究低氧条件对肿瘤细胞增殖、迁移及相关基因表达的影响，为肿瘤的发病机制研究和靶向治疗提供理论依据。

2、借助三气培养箱创建厌氧环境，实现厌氧微生物的分离培养与特性研究，探索厌氧微生物在生态系统物质循环和生物技术领域的潜在应用价值。

二、实验设计

（一） 实验材料

1、细胞与微生物：

人肺癌细胞系A549，购自细胞库，复苏后在常规条件下培养至对数生长期。

厌氧微生物样本，采集自湖泊底泥，保存于厌氧运输管中。

2、试剂：

细胞培养：RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗、胰蛋白酶、低氧诱导因子-1α（HIF-1α）抗体、增殖细胞核抗原（PCNA）抗体、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）抗体。

微生物培养：厌氧培养基（含酵母浸粉、蛋白胨、葡萄糖等成分）、刃天青指示剂（用于检测厌氧环境）、无菌生理盐水。

3、仪器：三气培养箱（可精确调控O₂、CO₂、N₂浓度，温度控制范围为4℃-60℃，湿度≥90%）、倒置显微镜、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、蛋白免疫印迹（Western Blot）相关设备、厌氧手套箱（辅助厌氧微生物操作）。

（二） 样本分组与处理

1、肿瘤细胞实验：

常氧组：将A549细胞接种于含10%胎牛血清和1%双抗的 RPMI 1640培养基中，置于三气培养箱，设置环境条件为21% O₂、5% CO₂、74% N₂，37℃，湿度≥90%，每组设置6个生物学重复。

低氧组：同样接种A549细胞，培养基成分相同，但将三气培养箱环境条件调整为1% O₂、5% CO₂、94% N₂，37℃，湿度≥90%，每组设置6个生物学重复。

2、厌氧微生物实验：

将采集的湖泊底泥样本用无菌生理盐水进行梯度稀释，分别取10⁻²、10⁻³、10⁻⁴稀释度的菌液各0.1mL，均匀涂布于厌氧培养基平板上。

将涂布后的平板放入三气培养箱，设置环境条件为0% O₂、5% CO₂、95% N₂，35℃，湿度≥90%，每组平板设置3个生物学重复；同时设置需氧对照平板，放置于普通二氧化碳培养箱中培养。

三、实验操作步骤

（一） 肿瘤细胞培养与检测

1、细胞接种与培养：

取对数生长期的A549细胞，用胰蛋白酶消化后，调整细胞浓度至5×10⁵个/mL，分别接种于上述两组培养条件的6孔细胞培养板中，每孔加入2mL细胞悬液。

培养24小时后，在倒置显微镜下观察细胞形态并拍照记录；之后每隔24小时，采用细胞计数法测定细胞数量，绘制细胞生长曲线。

2、基因表达检测：

培养72小时后，收集两组细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，进行反转录合成cDNA。

利用荧光定量PCR仪，以β- actin为内参基因，检测HIF-1α、PCNA、MMP-2等基因的表达水平，分析低氧条件对相关基因转录的影响。

3、蛋白表达检测：

另取培养72小时的细胞，提取总蛋白，采用Western Blot技术检测 HIF-1α、PCNA、MMP-2蛋白的表达量，探究低氧环境下蛋白水平的变化。

（二） 厌氧微生物培养与鉴定

1、培养过程：

将涂布好的厌氧培养基平板放入三气培养箱后，通过观察刃天青指示剂颜色变化确认厌氧环境建立情况（无氧时指示剂由蓝色变为无色）。

培养5-7天后，观察厌氧微生物在平板上的菌落形态、颜色、大小等特征，并与需氧对照平板进行对比。

2、微生物分离与鉴定：

挑选厌氧平板上不同形态的单菌落，采用划线分离法进行纯化，重复3-4次直至获得纯培养物。

对纯化后的厌氧微生物进行16S rRNA基因扩增与测序，将测序结果与NCBI数据库进行比对，鉴定微生物种类。

四、实验结果分析

（一） 肿瘤细胞实验结果

1、细胞形态与增殖：

常氧组细胞呈梭形，贴壁生长良好，细胞间连接紧密；低氧组细胞形态发生改变，部分细胞变圆，贴壁能力减弱。

细胞生长曲线显示，低氧组细胞增殖速率明显低于常氧组，差异具有统计学意义（P< 0.05）。

2、基因与蛋白表达：

荧光定量 PCR 结果表明，低氧组HIF-1α、MMP-2基因表达水平显著高于常氧组（P< 0.01），而 PCNA 基因表达量降低（P<0.05）。

Western Blot 检测结果与基因表达趋势一致，低氧组HIF-1α、MMP-2蛋白表达上调，PCNA蛋白表达下调。

（二）厌氧微生物实验结果

1、培养与分离：

三气培养箱中培养的厌氧平板上，成功生长出多种形态的菌落，而需氧对照平板上几乎无菌落生长，表明三气培养箱创建的厌氧环境满足微生物生长需求。

经划线分离，共获得5株纯培养的厌氧微生物。

2、鉴定结果：

16S rRNA基因测序比对显示，5株厌氧微生物分别属于拟杆菌属（Bacteroides）、梭菌属（Clostridium）等不同的分类单元，为后续深入研究其功能特性奠定基础。

五、实验结论

本实验通过肿瘤细胞低氧培养和厌氧微生物培养两项研究，充分验证了博清生物科技（南京）有限公司研发生产的三气培养箱在科研实验中的重要作用和应用价值。在肿瘤细胞研究方面，博清生物科技（南京）有限公司研发生产的三气培养箱能够精准模拟低氧微环境，显著影响肿瘤细胞的生长、迁移及相关基因和蛋白的表达，为肿瘤生物学研究提供了可靠的实验条件。在厌氧微生物培养中，博清生物科技（南京）有限公司研发生产的三气培养箱可有效创建稳定的厌氧环境，实现厌氧微生物的分离培养与鉴定，有助于挖掘厌氧微生物资源的潜在应用。实验结果表明，博清生物科技（南京）有限公司研发生产的三气培养箱凭借其精确的气体浓度调控、稳定的温度和湿度控制，能够满足多种科研实验需求，是开展生命科学研究的重要技术支撑。未来可进一步拓展三气培养箱在其他特殊培养条件下的应用，探索其在更广泛科研领域的潜在价值。